1 引 言
自60年代Clark發(fā)明葡萄糖氧化酶(GOD)——過氧化氫產(chǎn)物的酶電極、80年代證實(shí)皮下組織(S.C.)液的葡萄糖(G.S.)濃度與血的一致以來〔1〕，利用酶電極并從S.C.采樣以動(dòng)態(tài)監(jiān)測血糖的研究正在走向?qū)嵱秒A段。本文將所構(gòu)建的新的脈沖式微透析法葡萄糖傳感器系統(tǒng)及其體外特性、抗干擾能力和溫度特性的研究報(bào)道于下。
2 檢測原理和實(shí)驗(yàn)方法
2.1 檢測原理
脈沖式微透析法葡萄糖傳感器系統(tǒng)的檢測原理參見圖1。
圖1 脈沖式微透析葡萄糖傳感器系統(tǒng)的檢測原理
圖中的脈沖式微泵內(nèi)裝有CPU，可按需定時(shí)定量泵出液體。本研究中每20分鐘泵磷酸緩沖液(pH7.4)20μl至微透析探針的導(dǎo)管內(nèi)。導(dǎo)管外層為微透析膜。導(dǎo)管內(nèi)外液體中的各物質(zhì)依據(jù)各自的濃度梯度在20分鐘內(nèi)從高濃度向低濃度擴(kuò)散。在體內(nèi)，探針置于S.C.,故S.C.中的G.S.將向緩沖液中擴(kuò)散。在本研究中，探針置于不同濃度的G.S.中。其后，含G.S.的緩沖液經(jīng)管道系統(tǒng)泵入流動(dòng)室。流動(dòng)室以白金為陽極，電壓+700mv,Ag/Agcl為陰極。室外是改良的YSI酶膜，其上固定著GOD和過氧化氫酶。在酶膜和電極之間是一層Teflon膜，以濾過大分子干擾物。G.S.在流動(dòng)室的反應(yīng)如下〔2〕：
與流動(dòng)室相連的電流計(jì)將此反應(yīng)電流放大、輸出。電流的大小與G.S.濃度成正比，其值由曲線記錄儀記圖如圖2。
2 脈沖式微透析法葡萄糖傳感器輸出信號
脈沖式微泵、流動(dòng)室、微透析探針、殘液回收器由德國Eppendorf公司協(xié)同研制、提供；Biometra Ep 30電流計(jì)、BD101雙筆式曲線記錄儀、循環(huán)加熱器、溫度監(jiān)測儀均由德國呂貝克醫(yī)科大學(xué)Kerner教授實(shí)驗(yàn)室提供；酶膜及Teflon膜分別來自Yellow Spring器械公司和Universal Sensor ZNC；各種實(shí)驗(yàn)用化學(xué)品來自Sigma化學(xué)公司。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 葡萄糖恢復(fù)的檢測
按圖1連接脈沖式微泵和微透析探針、管道，其末端接一微管。將探針分別放入盛有5.5mM和10mM G.S.的燒杯中。每20分鐘在微管和燒杯中同時(shí)分別采等量樣本一次。每對樣本均在Backman葡萄糖檢測機(jī)上測定濃度。實(shí)驗(yàn)在此兩種濃度的G.S.中各進(jìn)行5次。
2.2.2 改良的YSI酶膜的制作
2.0%過氧化氫(Sigma (9284)20μl加入100μl的2.5%戊二FEB6液中，混勻，取60μl均勻滴于YSI膜的正面，37℃恒溫器上干燥12小時(shí)。
2.2.3 輸出電流與G.S.濃度間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)
按圖1連接整個(gè)系統(tǒng)。把微泵、流動(dòng)室、探針及裝有不同濃度G.S.的燒杯放入一密閉的金屬箱，此箱與循環(huán)加熱器相連，保持溫度于37℃。分別在0和10mM G.S.中運(yùn)行此系統(tǒng)30小時(shí)，所得基線穩(wěn)定，則以2.5，5，10，20mM G.S.濃度為梯度進(jìn)行漸增漸減實(shí)驗(yàn)，每一濃度試驗(yàn)1小時(shí)20分，從2.5～20mM G.S.為一個(gè)循環(huán)，共行12個(gè)循環(huán)。
2.2.4 抗干擾試驗(yàn)
在37℃讓整個(gè)系統(tǒng)于0和10mM G.S.中分別工作12和30小時(shí)，性能穩(wěn)定則從0.05，0.1，0.2，0.3mM的抗壞血酸或醋氨酚液(均不含G.S.)為梯度進(jìn)行試驗(yàn)。每一濃度試驗(yàn)1小時(shí)20分。兩種干擾物各試驗(yàn)3次。
2.2.5 溫度實(shí)驗(yàn)
用溫度監(jiān)測儀監(jiān)測金屬箱內(nèi)的溫度。從20逐步上升至40℃，再漸降至20℃，每5℃為一梯度，每一溫度保持1小時(shí)，同一系統(tǒng)分別在0和10mM G.S.中各進(jìn)行一次則為一個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)循環(huán)。本研究共進(jìn)行了3個(gè)循環(huán)。
各實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用Sigma Plot 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
3 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果
在5.5和10mM G.S.杯中各取5份標(biāo)本及配對的經(jīng)微透析采樣的標(biāo)本各5份，同在Backman機(jī)上測定、配對計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示本系統(tǒng)微透析探針的葡萄糖恢復(fù)為97±2.2%，遠(yuǎn)高于Y.Hashigrouchi 35.6±0.2%的報(bào)道。〔3〕
圖3顯示0至20mM G.S.中，G.S.濃度與電極輸出電流間均呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均值達(dá)0.986。
圖3 傳感器電流與葡萄糖濃度的相關(guān)性
本系統(tǒng)的體外特性如表1。背景電流較其他文獻(xiàn)報(bào)告更低〔4〕，與Y.Haslugrocli等的相同〔3〕，均是至今報(bào)告中最低的。30小時(shí)的漂移值未見報(bào)道。5.5mM G.S.中測試24小時(shí)所得最低漂移值為0.255%-1mM-1h〔5〕，本研究10mMG.S.中測試30小時(shí)的漂移值為0.103%-1mM-1h。由于G.S.濃度越高，傳感器運(yùn)行時(shí)間越長，其漂移程度越明顯，所以本組的結(jié)果是迄今為止報(bào)告的最低值，且意義更大。
表2的抗干擾結(jié)果顯示：0.1mM的抗壞血酸與電極輸出電流無相關(guān)性。較高濃度的抗壞血酸和各濃度的醋氨酚液均只引起微小的干擾電流。
從圖4、5中可見在雙蒸水中，傳感器輸出電流隨溫度升高而增加，此種現(xiàn)象在10mMG.S.時(shí)更明顯，但同一溫度值時(shí)輸出電流值較接近。
圖4 0mMG.S.中溫度實(shí)驗(yàn) 圖5 10mM G.S.中溫度實(shí)驗(yàn)
三次10mMG.S.溫度實(shí)驗(yàn)中的溫度系數(shù)分別為3.63%、2.96%、3.63%。其計(jì)算公式如下：
式中：Itmax、Itmin和It35℃分別為最高溫度、最低溫度和35℃時(shí)的穩(wěn)態(tài)電流值；tmax、tmin為最高和最低溫度。
4 討 論
20多年來許多專家致力于持續(xù)監(jiān)測血糖的研究，但存在以下問題：一、微透析膜兩側(cè)物質(zhì)擴(kuò)散不充分，使葡萄糖的恢復(fù)不完全。半透膜的物質(zhì)擴(kuò)散與兩側(cè)的物質(zhì)濃度梯度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)。二、上述不完全性影響了測量的準(zhǔn)確性，因而需用體內(nèi)兩點(diǎn)法來校正〔6〕。即在病人身上人為地造成高、低血糖狀態(tài)。這對危重病人來講是十分危險(xiǎn)的，并需較長的檢測前校正時(shí)間而不具及時(shí)性。三、持續(xù)監(jiān)測時(shí)血糖濃度信號連續(xù)變化不斷，難免前后信號互相干擾，影響檢測的準(zhǔn)確性和可信性。最后，持續(xù)監(jiān)測血糖需攜帶較多的緩沖液，不利于小型化。我們從實(shí)際需要考慮，提出間歇監(jiān)測血糖的新思路，采用脈沖式微泵，使前后電信號相隔20分鐘發(fā)出。圖2已示本傳感器電流20分內(nèi)已穩(wěn)定于基線，達(dá)到避免前后電信號互相干擾的目的。改良的YSI膜在這方面也有貢獻(xiàn)。當(dāng)只存在GOD時(shí)，電極陽極端汲出電子的過程相對緩慢，故峰電流回基線需數(shù)十分鐘，其間第二個(gè)峰電流已發(fā)出，因前者未達(dá)基線，故從較高水平開始上揚(yáng)，出現(xiàn)干擾。改良的YSI膜中加了過氧化氫酶，加快了電子汲出過程，使在瞬間產(chǎn)生快速上揚(yáng)和下降的峰電流并很快達(dá)基線。這一結(jié)果使電極輸出電流與G.S.濃度間的直線相關(guān)性更好、更可信。未采用改良的YSI膜時(shí)，系統(tǒng)的背景電流為0.7±0.2nA，電極輸出電流與G.S.濃度間的直線相關(guān)系數(shù)為0.92〔4〕，此事實(shí)也支持上述分析。脈沖式微泵24小時(shí)泵液1.44ml，回收的殘液更少，使傳感器系統(tǒng)更小；與微透析技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，幾乎達(dá)到葡萄糖完全恢復(fù)，故不需體內(nèi)校正，更安全、方便和及時(shí)。從臨床來講也無須每分每秒監(jiān)測血糖，因血糖的較大波動(dòng)、藥物作用的發(fā)揮都需一定的時(shí)間。
在體外實(shí)驗(yàn)中，影響電流漂移最主要的因素是傳感器的結(jié)構(gòu)和傳導(dǎo)層。理想的漂移結(jié)果提示本傳感器結(jié)構(gòu)合理及改良酶膜的重要。因?yàn)镚OD固定于膜及第二種酶(如過氧化氫酶)的使用可改善傳感器的穩(wěn)定性是眾所周知的〔2〕。
雖然GOD對β-D-G.S.是非常特異的，但這種特異性被電極的不良選擇性所減低。在適當(dāng)?shù)碾妷悍秶鷥?nèi)，電極能氧化所有存在于液體中的可氧化物質(zhì)。因而必須限制干擾物進(jìn)入傳感器。血液和組織液中的許多生化物質(zhì)和藥物，如抗壞血酸和醋氨酚，或通過電極的氧化，或通過與G.S.產(chǎn)生的過氧化氫發(fā)生反應(yīng)而干擾傳感器的功能〔8〕。本系統(tǒng)采用了Teflon膜及改良的YSI膜，對上述干擾物的各個(gè)干擾環(huán)節(jié)均能發(fā)揮限止作用。尤其是改良的YSI膜能在瞬間分解過氧化氫，因而在減少過氧化氫與干擾物起反應(yīng)的機(jī)會(huì)中具有重要意義。人體血液抗壞血酸的正常范圍是23～85μl〔9〕；服藥者血液中醋氨酚為13～40μl。本組抗干擾實(shí)驗(yàn)所用的濃度均超過上述值數(shù)倍至數(shù)百倍，但其最大干擾電流也小于10mMG.S.電流的4%，可以忽略不計(jì)，證實(shí)本系統(tǒng)具有較強(qiáng)的抗干擾能力。
葡萄糖傳感器輸出電流隨溫度的升高而增大是酶電極傳感器的特性。這種特性干擾了傳感器對發(fā)熱病人血糖監(jiān)測的準(zhǔn)確性，限止了它的臨床應(yīng)用。本研究所得的溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其在20至40℃雙蒸水中，輸出電流最大變化也小于4nA，無干擾意義。同一溫度時(shí)電極輸出電流有些差異，主要由金屬箱溫度傳遞差異和G.S.在溫度增高時(shí)水份蒸發(fā)所致，故不影響實(shí)用。在G.S.中由于酶在接近最佳功能溫度時(shí)(GOD與過氧化氫酶為37℃)活性明顯增加，所以存在干擾電流。據(jù)此，我們以溫度——輸出電流呈直線關(guān)系為假設(shè)，以35℃為基本條件(正常人S.C.溫度多在35℃左右)，計(jì)算得溫度系數(shù)為3.4%左右(10mMG.S.中)，即溫度每升高1℃，輸出電流增加3.4%。盡管從圖4、5中知道溫度—輸出電流間并非直線關(guān)系，但知道溫度系數(shù)的大致范圍后可采用各種方法(如曲線補(bǔ)償法、計(jì)算機(jī)程序補(bǔ)償法等)補(bǔ)償兩者間的大部分偏差。加之體溫高于40℃時(shí)，S.C.仍很少超過40℃，故實(shí)際的溫度變化更小。另外，高熱時(shí)糖尿病者往往有嚴(yán)重并發(fā)癥，后者使血糖大幅度增加，相比之下，經(jīng)大部分校正后的溫度所引起的輸出電流的增加就顯得不重要了。因此，本系統(tǒng)在發(fā)熱患者中確有應(yīng)用價(jià)值。
5 結(jié) 論
我們在此介紹的葡萄糖傳感器系統(tǒng)具有體積小，校正簡便、安全、及時(shí)，傳感器性質(zhì)穩(wěn)定、檢測精度高和抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)也有較理想的溫度特性。此系統(tǒng)攜帶方便、應(yīng)用范圍廣、操作簡便安全，更符合臨床實(shí)際需求。
