多聚甲醛固定后，白細胞的免疫表型通常會有所變化。而且，在固定之后，對細胞表面 Marker 的熒光穩(wěn)定性也會產(chǎn)生很大影響。為了獲得不同表面 Marker 的熒光穩(wěn)定性，了解固定后細胞的光散射特性和射門以及固定細胞后產(chǎn)生自發(fā)熒光是非常必要的。
在固定細胞 0、2、4、6、24、48、96 h 后，用 FITC 標記抗體對全血進行染色測定。通過檢測可溶性熒光素當量分子 (MESF) 來定量分析熒光強度。結(jié)果顯示出，固定作用 48 h 后，細胞大小（FSC）和細胞顆粒度 (SSC) 能夠引起顯著的下降，在單核細胞中，固定作用 96 h 后，自發(fā)熒光急劇增加，是固定前的 9 倍。
從自發(fā)熒光的來看：未染色的樣本在固定之后上機檢測顯示，熒光強度相比固定之前有所增強，自發(fā)熒光被糾正后，固定前樣本間沒有明顯的區(qū)。在細胞固定后，淋巴細胞、單核細胞、粒細胞的自發(fā)熒光持續(xù)增加，96 h 達到最高點。判斷熒光標記的穩(wěn)定性之前要先進行自發(fā)熒光的校正。
大體上來講，細胞固定后 48 h，細胞大小（FSC）發(fā)生明顯降低，但到了 96 h 后則基本保持不變。在淋巴細胞、單核細胞、粒細胞均發(fā)生同樣的變化。同樣的，SSC 在某種程度上也出現(xiàn)降低的特點。
文獻中 Denny 稱：在固定 1、24 h、48 h 后，通過檢測熒光強度說明抗體與細胞結(jié)合能力是發(fā)生了一些變化。在固定 24 h 后，CD3、CD19 有明顯增加，而 CD4、CD8、CD16 則沒有明顯改變。在固定 48 h 后，CD3、CD4、CD19 急劇增加，使用固定后洗滌的方式，不同的表面抗原也有不同的改變，CD4、CD8、CD19 是穩(wěn)定的，沒有發(fā)生顯著變化，而 CD3 的熒光強度卻發(fā)生降低。
兩種可能引起熒光強度衰退的原因：
1.NaN3；經(jīng)試驗驗證，樣本固定在 1%PFA 的 PBS（不含 NaN3）中，標記抗體的熒光強度并未發(fā)生顯著的變化。
2. 固定的時間；經(jīng)試驗驗證，在固定 30 min 后，用 PBS（含 NaN3）重懸細胞后，自發(fā)熒光增加較為平緩。而在進行自發(fā)熒光校準之后，標記抗體的熒光強度沒有影響。 隨著固定時間的延長，粒細胞的大小（FSC）和顆粒度 (SSC) 都有明顯的降低。而淋巴細胞和單核細胞都被粒細胞覆蓋上，對射門來講都是非常困難的。
參考文獻： Changes in Fluorescence Intensity of Selected Leukocyte Surface Markers Following Fixation； Judith C.Stewart；Michelle L.Villasmil ；Mark W.Frampton 等。
